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一、什么是基因敲高？
在给大家介绍基因敲高的概念之前，先给大家介绍一下基因敲除（Knock-out，KO）的概念。基因敲除是20世纪80年代以来发展起来的一种新型分子生物学技术，该技术通过一定的途径使生物体中特定的基因丧失功能。最早在动物细胞中，通过DNA同源重组的原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，可以实现基因敲除的目的。随着实验技术的发展，除了同源重组外，开始有新的技术出现并且被应用于各种物种的基因功能研究，最广为人知的有基因沉默（RNAi）和CRISPR/Cas9系统介导的基因敲除。通过这两种技术虽然不能使原本的靶基因完全缺失，但是最终都通过使靶基因的mRNA降解或者使蛋白表达异常达到基因敲除的目的。
基因敲高（Knock-up）是指通过各种手段实现对靶基因表达量的提高。想要过表达某个基因的时候，通常会先构建过表达载体再转入到植株中从而实现靶基因表达量的提高，或者在靶基因附近插入增强子(Claeys et al., 2023)，但是这些方法都会不可避免的引入外源序列，所以在未来育种应用方面可能会受到限制，如果能在不引入外源序列的前提下实现靶基因的上调，将有利于实际推广应用。本文将重点给大家介绍在不引入外源序列的同时也不改变基因编码序列的前提下，实现上调靶基因表达量的方法及相关案例。
二、基因敲高的相关方法
在不引入外源序列也不改变基因编码序列的条件下实现基因敲高的具体方法包括对靶基因启动子区域进行编辑、对基因UTR区进行编辑、通过靶基因同一染色体上其他基因的启动子去驱动靶基因等。接下来就让伯小远给大家具体介绍一下这几种方法的文献案例吧！
例子一：通过对启动子的编辑实现基因敲高
2023年3月，扬州大学梁国华/周勇课题组联合上海市农业科学院吴书俊课题组在Plant Biotechnology Journal杂志上发表了一篇题为“Rapid production of novel beneficial alleles for improving rice appearance quality by targeting aSLG7promoter regulatory element”的研究论文。该研究通过CRISPR/Cas9技术编辑水稻（WYJ30）细长粒型的主效QTL（Quantitative trait loci）SLG7的启动子关键调控元件（图1a、b），结果发现对T3区域启动子的编辑可以提高SLG7基因的表达，从而增加籽粒长宽比、减少垩白率，提高籽粒的外观质量（图1c-g），同时这种变化并没有导致产量和口感等方面有明显的降低（图1h-l）。
图1 对SLG7基因启动子的编辑可通过提高其表达量从而提升水稻籽粒的优良性状(Tan et al., 2023)。（a-b）对SLG7基因启动子不同位点进行编辑，获得不同编辑形式的植株。（c、e）对于T3区域启动子的编辑提高了SLG7的表达量，以及籽粒的长宽比。（d、f、g）WYJ30-T3-1，WYJ30-T3-2以及WYJ30-T3-3的垩白率降低。（h、 j）直链淀粉含量测定以及粘度指数测定。（i）胶稠度测定。（k）单株产量测定。（l）口感测定。
为了进一步探索为什么对T3区域启动子进行编辑会导致SLG7表达量上调以及上述性状的改变，作者分析了该编辑区域，发现该区域存在一个AC II顺式调控元件（ACCAATCC），该顺式调控元件可以与转录因子AH2互作，且在已有研究中表明AH2是一个转录抑制因子。因此作者猜想是否是因为T3位点的突变导致了AH2与SLG7的启动子互作减弱从而导致了SLG7表达量的升高，通过酵母单杂、EMSA以及双荧光素酶报告基因实验（Dual-LUC实验）证实T3位点的突变确实会导致AH2与SLG7的启动子互作强度减弱（图2）。
图2 转录抑制因子AH2能结合T3区域上的AC II序列(Tan et al., 2023)。（a-b）酵母单杂验证AH2与SLG7启动子以及T3区域突变后的启动子的互作验证。（c）EMSA验证AH2结合AC II情况，T3位点的突变会导致AH2与启动子的互作强度减弱。（d）Dual-LUC实验验证AH2对原始启动子活性以及T3区域突变启动子活性的抑制情况。（e）AH2突变后SLG7的表达量上调，再次证明了AH2是一个转录抑制因子。
综上，通过对启动子区域的编辑可以实现靶基因表达量的上调，从而实现靶基因的基因敲高。其内在的分子调控机制是转录抑制因子与突变后启动子区域的顺式调控元件结合减弱，从而导致对靶基因的转录抑制减弱，最终表现为靶基因的转录上调，即基因敲高。如果有些顺式作用元件结合的是转录激活因子，那么该顺式作用元件的突变会导致基因的表达降低，相关案例可以查看之前的推文“听说现在都流行微调？”哦！
图3 对SLG7启动子的编辑可以实现SLG7基因敲高的分子模式图(Tan et al., 2023)。
例子二：通过对5' UTR基因序列的编辑实现基因敲高
真核细胞的mRNA由5'非翻译区（5'UTR）、编码蛋白的开放阅读框区（ORF）及3'非翻译区（3'UTR）构成。研究发现，5'UTR中存在一些具有翻译能力的开放阅读框，被称为上游开放阅读框（uORF）。与之对应，5'UTR下游的开放阅读框被称为主开放阅读框（pORF或mORF），uORF可以影响pORF mRNA的翻译。虽然这种方法不影响靶基因的表达量，但是可能会使靶基因的蛋白水平上调，所以在此处还是将其归为基因敲高这一类中。值得一提的是，uORF在真核生物中广泛存在，因此通过这种方法实现基因敲高可能具有普遍适用性。
2018年8月6日，中科院遗传发育研究所高彩霞课题组在Nature Biotechnology杂志上发表了一篇题为“Genome editing of upstream open reading frames enables translational control in plants”的研究论文，该论文通过对uORF进行基因编辑，实现了对靶基因的翻译调控。在初期实验中，作者通过Dual-LUC实验发现在uORF的三种编辑形式中（图4a），对uORF起始密码子（uATG）进行删除会导致LUC/REN的活性水平显著高于对照组，将uATG突变成其他形式（AAA）也能导致类似的结果，但是这三种编辑形式均不能影响LUC/REN的mRNA水平（图4b）。综上，对uATG的编辑可以改变pORF的翻译水平，这是另外一种实现基因敲高的方法！
图4 对uORF的不同编辑形式可以影响pORF的翻译水平(Zhang et al., 2018)。（a）针对uORF区域设计了三种不同的编辑形式。（b）通过Dual-LUC实验检测了三种不同编辑形式对LUC/REN的活性水平以及LUC/REN的mRNA水平的影响。
在上述实验中验证了通过编辑uORF实现上调pORF翻译水平的可行性，作者进而对拟南芥发育关键基因AtBRI1进行了uATG的定向编辑，获得了两个突变体uorfAtBRI1-1和uorfAtBRI1-2，这两个突变体的uATG上都有一个核苷酸的插入（图5a）。后续实验证明，相比于对照组，uorfAtBRI1-1和uorfAtBRI1-2中AtBRI1的mRNA水平没有显著差异，但是蛋白水平显著高于野生型（图5b，c），这与前面初期实验的结果有相似性。已有研究表明过表达AtBRI1可降低油菜素内酯对拟南芥下胚轴生长的抑制作用，与此一致的是，在外源油菜素内酯的处理下，uorfAtBRI1-1和uorfAtBRI1-2的下胚轴长度都要高于野生型（图5d）。
有意思的是，相比于uorfAtBRI1-1，uorfAtBRI1-2在各项表型上要更为明显，作者猜测可能是因为uorfAtBRI1-1的uATG无意中突变成了GTG，而恰好GUG也能作为起始密码子，这可能就导致uorfAtBRI1-1的uORF还存在部分的翻译。除了拟南芥中的AtBRI1之外，该研究中还对生菜中几个关键基因进行了类似的编辑，同样也实现了基因敲高的目的，这使生菜的抗氧化能力提高，感兴趣的同学可以自己查阅原文了解一下哦！
图5 uATG单核苷酸插入突变中AtBRI1的mRNA水平无明显差异但蛋白水平上调(Zhang et al., 2018)。（a）对AtBRI1进行不同的单核苷酸插入突变。（b）uorfAtBRI1-1和uorfAtBRI1-2中mRNA水平分析。（c）uorfAtBRI1-1和uorfAtBRI1-2中蛋白丰度分析。（d）在外源油菜素内酯的处理下，野生型和uorfAtBRI1-1和uorfAtBRI1-2下胚轴长度比较。
综上，对uORF序列进行编辑也能够实现对靶基因的基因敲高，其分子机制是uORF的存在可能会导致pORF的翻译水平下降，通过对uATG进行编辑后，可能会减弱uORF的翻译水平从而提高pORF的翻译水平。
图6 通过对uORF的编辑可以实现靶基因的基因敲高(Zhang et al., 2018)。
例子三：通过对3' UTR基因序列的编辑实现基因敲高
除了编辑5'UTR能实现基因敲高之外，对3'UTR的编辑同样能实现基因敲高。2023年11月，中国科学院遗传与发育生物学研究所李家洋院士课题组在Plant Communications杂志上发表了一篇题为“Genome editing of 3' UTR-embeded inhibitory region enables to generate gene knock-up alleles in plants”的研究论文，该研究通过对植物基因3'UTR中的负调控区域进行敲除，开发了一种基因敲高的新方法。对水稻和拟南芥的3个基因OsLTT7、OsSBI和AtTPPD进行改造，实现了其中2个基因OsLTT7、AtTPPD的mRNA水平上调以及全部3个基因的蛋白水平上调，其中OsSBI表达量下调可能是因为对3'UTR的编辑导致了mRNA的稳定性下降，而这种影响小于翻译调控，所以最终还是表现为蛋白水平的上调。由于篇幅有限，伯小远在此处主要给大家介绍OsLTT7的相关实验。
与上面一篇文章的思路类似，作者首先通过Dual-LUC实验验证了对OsLTT73'UTR的编辑会导致LUC/REN的翻译水平上调，其中Del2类型（388至792区域序列的缺失）编辑上调最多（图6A）。之后，作者针对OsLTT7的3'UTR区域进行了编辑，结果发现两种形式的编辑OsLTT73'utrL1、OsLTT73'utrL2均能使OsLTT7的mRNA水平上调以及蛋白水平上调（图6C、D）。已有的研究表明OsLTT7的过表达能增强水稻幼苗的抗寒性，因此作者检测了OsLTT73'utrL1和OsLTT73'utrL2幼苗的抗寒性，结果显示，经过寒冷条件处理后其存活率显著高于野生型。
图7 对OsLTT7进行编辑后能提高其mRNA水平、蛋白水平以及水稻抗寒能力(Wang et al., 2023)。（A）通过Dual-LUC实验检测OsLTT73'UTR区域不同位置的缺失对翻译水平的影响。（B）通过基因编辑删除OsLTT73'UTR中可能影响转录和翻译的关键序列。（C、D）检测OsLTT73'utrL1和OsLTT73'utrL2中OsLTT7的mRNA水平以及蛋白水平。（E、F）检测OsLTT73'utrL1和OsLTT73'utrL2植株的抗寒性以及处理后的存活率。
综上，通过编辑3' UTR能够实现对靶基因的基因敲高，其分子机制是3' UTR负调控区域通常包含miRNA特异性识别的顺式元件，或者形成比较稳定的RNA二级结构从而抑制mRNA的翻译，因此对这些关键序列的编辑就可以避免mRNA翻译效率下降的情况，也就能够实现基因敲高的目的。近期李家洋院士课题组以类似的研究套路在Plant Biotechnology Journal上发表了另外一篇研究论文，该研究发现对靶基因的5'UTR进行编辑可以实现靶基因表达量的上调或下调，感兴趣的同学可以自行去了解一下哦(Wang et al., 2023)。
图8 通过对3'UTR的编辑可以实现基因敲高从而提高水稻的抗寒性(Wang et al., 2023)。
例子四：通过同一条染色体上的强启动子驱动弱表达基因实现基因敲高
2021年11月，中国农业大学植物保护学院姜临建课题组联合其他单位在Nature Plants杂志上发表了一篇题为“A Donor DNA-free CRISPR-Cas-based Approach to Gene Knock-up in Rice”的研究论文，该研究通过CRISPR/Cas9设计大规模的基因组倒置或重复，在不插入外源序列的同时寻求提高重要农艺性状的变异。
编辑后发现，1号染色体上911kb序列的倒置导致了CP12和PPO1之间的启动子发生了交换，形成了promoterCP12::PPO1和promoterPPO1::CP12（图9a）。2号染色体上HPPD和Ubiquitin2之间338kb序列的重复在连接处形成了一个新的基因盒，即promoterUbiquitin2::HPPD（图10a）。在这两种情况下，由于CP12和Ubiquitin2在叶片中高表达，因此两者的启动子属于较强活性的启动子，在该启动子的驱使下，在得到的编辑苗INV-L1/L2/L3（promoterCP12::PPO1）、DUP-L1/L2/L3（promoterUbiquitin2::HPPD）中，PPO1、HPPD的mRNA水平显著上调同时蛋白水平也显著上调（图9b、c和图10b、c）。之前的研究表明过表达PPO1和HPPD的植株分别对除草剂FCD和bipyrazone的抗性增强，作者通过检测也发现INV和DUP编辑苗也表现出对FCD和bipyrazone抗性增强的表型（图9d、e和图10d、e）。值得一提的是，INV和DUP编辑苗并不会出现其他重要性状的改变。
图9CP12和PPO1之间的启动子交换提高PPO1的mRNA水平、蛋白水平以及水稻对除草剂FCD的抗性(Lu et al., 2021)。（a）CP12和PPO1之间911kb序列发生了倒置。（b-c）检测倒置后CP12和PPO1mRNA水平以及蛋白水平差异（1号泳道野生型；2号泳道过表达CP12植株；3-5号泳道INV植株）（d）INV-L1和INV-L2对除草剂FCD的抗性检测。（e）检测911kb序列的反转是否导致水稻株高、分蘖数、抽穗期以及单株产量的变化。
图10HPPD和Ubiquitin2之间序列的重复提高HPPD的mRNA水平、蛋白水平以及水稻对除草剂bipyrazone的抗性(Lu et al., 2021)。（a）HPPD和Ubiquitin2之间338kb序列发生了重复。（b-c）检测重复后HPPD和Ubiquitin2mRNA水平以及蛋白水平差异（1号泳道过表达HPPD植株；2号泳道野生型；3-5号泳道INV植株）（d）DUP-L1和DUP-L2对除草剂bipyrazone的抗性检测。（e）检测338kb序列的重复是否导致水稻株高、分蘖数、抽穗期以及单株产量的变化。
综上，对同一条染色体上的序列的倒置和重复可以实现强启动子驱动弱表达基因的结果，这也是基因敲高的一种方法，但是由于这种方法会导致基因组上长片段序列的改变，并且需要确定编辑植株中的长片段序列是否真的会发生想要的倒置或重复，所以鉴定起来可能会麻烦一些。此外，将基因组进行序列倒置时，可能还需要考虑其中一个基因表达量降低所带来的影响。而在引入重复序列时，重复部分的基因表达量可能会因为加倍而上调，这所带来的影响也是需要考量的。最为重要的是，要考虑在达到提高靶基因表达及翻译水平上调的目的时，会不会导致一些不利的性状出现。
经过这几篇文献的介绍，相信大家对基因敲高的概念以及相关的手段都有所了解了，接下来小远给大家简单总结一下这几篇文献案例的核心思路。基于不插入外源序列以及不改变基因编码序列的前提下，要想实现基因敲高就只能从转录以及翻译层面下手。（一）对启动子进行编辑，因为启动子上可能存在某些转录抑制因子的结合位点，对这些位点的编辑可能可以减弱对靶基因的转录抑制，从而提高表达量。（二）对UTR区进行编辑，5' UTR区中可能存在uORF，而uORF干扰靶基因的翻译过程，对uATG的编辑可以减弱uORF对靶基因翻译的影响，从而提高表达量，虽然这种方法并不能上调靶基因的mRNA水平但却能上调其蛋白水平。此外，3' UTR上可能存在miRNA结合位点以及稳定的RNA二级结构，对这些位点进行编辑后同样可能会实现靶基因表达量的提高。（三）基于基因组序列的倒置和重复，可以通过基因编辑手段人为制造想要的倒置和重复，从而让同一条染色体上的强启动子去驱动弱表达的基因，实现靶基因表达量的提高。
由于本文只介绍了以上几种方法，所以还有其他可以实现基因敲高的方法没有介绍，比如CRISPR/dCas9技术，该技术可以在体内招募转录激活因子到靶基因转录起始位点进行转录激活从而实现基因敲高，感兴趣的同学可以自行了解一下。总而言之，这些方法为作物遗传育种提供了新的思路和方法，在未来通过这些方法可以获得具有优良性状的品种。
References：
Claeys H, Neyrinck E et al. Coordinated gene upregulation in maize through CRISPR/Cas-mediated enhancer insertion.Plant Biotechnol J, 2023.
Lu Y, Wang J et al. A donor-DNA-free CRISPR/Cas-based approach to gene knock-up in rice.Nat Plants, 2021, 7: 1445-1452.
Tan W, Miao J et al. Rapid production of novel beneficial alleles for improving rice appearance quality by targeting a regulatory element ofSLG7.Plant Biotechnol J, 2023, 21: 1305-1307.
Wang H, Chen M et al. Shaping rice Green Revolution traits by engineering ATG immediate upstream 5'-UTR sequences ofOsSBIandOsHTD1.Plant Biotechnol J, 2023.
Wang H, Zhang D et al. Genome editing of 3' UTR-embedded inhibitory region enables generation of gene knock-up alleles in plants.Plant Commun, 2023, 100745.
Zhang H, Si X et al. Genome editing of upstream open reading frames enables translational control in plants.Nat Biotechnol, 2018, 36: 894-898.
